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第一步反应是按化学计算量进行；第二步青霉噻唑烷酸在酸性条件下被碘氧化的反应受温度、pH、时间等诸多因素影响，故耗碘量没有固定的量关系。因此试验过程中要严格控制温度，同时采用与青霉素标准品平行对照测定，则可抵消上述可变因素的影响。
碘与青霉噻唑酸的作用以Ph4.5，温度在24～26℃为最好。1摩尔青霉素能吸收8摩尔的碘，故本法的灵敏度较高。
注意：在滴定终点时放慢滴定速度，并强力振摇；如果滴定至终点又返现蓝色，说明真正的终点尚未到达。
⑵汞量法（青霉素钠、青霉素钾）
青霉素分子不与汞盐反应，而其碱性水解产物青霉噻唑酸及继续水解生成的青霉胺都能与汞盐定量反应，根据消耗的汞盐量可以计算青霉素的含量。
电位滴定法：指示电极：铂电极；参比电极：汞-硫酸亚汞电极。滴定液：硝酸汞。
每1ml的硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的总青霉素。
总青霉素的百分含量与降解产物的百分含量之差值即为青霉素的含量。
注意：青霉素含量计算以第二次滴定终点为依据；水解必须完全；空白试验也要称取供试品，但不经氢氧化钠水解；与碘量法比较，汞量法测定青霉素的主要优点是不需要青霉素标准品作对照，汞盐滴定液用EDTA标定即可。
⑶酸碱滴定法（苯唑西林钠）
⑷紫外-可见分光光度法⑸高效液相色谱法氨基糖苷类抗生素
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