青霉素v钾及其片剂的鉴别、杂质检查和含量测定方法。

　　掌握硫酸链霉素、硫酸庆大霉素的鉴别、检查和含量测定方法。

　　熟悉罗红霉素的鉴别、检查和含量测定方法。

　　熟悉盐酸美他环素的鉴别、检查和含量测定方法。

　　第一节 概述

　　抗生素类药物种类繁多，性质复杂。

　　来源：多数生物合成（发酵），少数化学合成或半合成制得。

　　特点：生产技术复杂、不易控制，异物污染可能性较大（虽经精制提纯，仍常含有杂质）；多数不稳定，分解产物带入，使降低、无效或有毒性。

　　各国药典均制定了"性状、鉴别、检查及含量测定（效价测定）"

　　检查项下，除"水分、溶液的澄清度与颜色、酸碱度、乙醇中不溶物、硫酸盐、炽灼残渣、重金属"外，还规定"异常毒性、热原、降压物质、无菌"等，此外，还规定"结晶性、抽针试验、悬浮时间与抽针试验、吸碘物质" 等。

　　效价测定方法生物学法和化学及物理化学法两大类：

　　生物学方法：是以抗生素对细菌的效应（抑制细菌生长或杀菌力）作为衡量效价的标准。优点：原理和临床使用的要求一致，更能够确定抗生素的医疗价值，方法 灵敏度高，纯度要求低，适用与已知或新发现的抗生素，同一类不需分离，可一次测定总效价。缺点：操作步骤多、测定时间长，误差大。

　　化学及物理化学法：是利用其特有的化学和物理化学性质及反应而进行测定。适用于提纯的及化学结构已确定的抗生素，迅速、准确、专属性强。缺点：杂质往往有相同的结构，对纯度要求高，一类抗生素的共同结构反应时，所得结果，只能代表药物总的含量，不代表生物效价。

　　通常理化方法要求：正确可靠、专属性强、操作简便、省时、试剂易得、样品用量少、测定结果与生物效价一致。

　　各国药典所载的理化方法测定的抗生素有：β-内酰胺类、氯霉素类、及灰黄霉素等，其中hplc法应用越来越广。

　　第二节 β-内酰胺类抗生素

　　青霉素族和头孢菌素族，分子中均含有β-内酰胺环，统称β-内酰胺类。

　　1.化学结构与性质

　　（一）化学结构 游离羧基和酰胺侧链。氢化噻唑环或氢化噻嗪环与β-内酰胺类合并的杂环，分别构成二者的母核。青霉素族中的母核称为6-氨基青霉烷酸（简称6-apa）；头孢菌素族中的母核为7-氨基头孢菌烷酸（简称7-aca）。

　　青霉素分子中含有3个手性碳原子（C3、C5、C6），头孢菌素分子中含有2个手性碳原子（c6、c7）。由于酰胺基上r和r1不同，构成不同的青霉素族和头孢菌素族药物，见表。

　　（二）性质

　　1.酸性：游离羧基酸性（大多青霉素的pka在2.5~2.8），能与无机碱或某些有机碱成盐；

　　2.溶解性：盐溶于水、有机碱盐易溶于甲醇等有机溶剂，盐遇酸析出白色沉淀；

　　3.旋光性：

　　4.紫外吸收特征：

　　青霉素母核无吸收，取代基有，如青霉素钾苄基，水溶液中在264nm波长处有最大吸收；

　　头孢菌素族由于母核有o=c-n-c=c结构，故有紫外吸收，如头孢氨苄的水溶液在262nm处，头孢唑林钠在272nm处有最大吸收；

　　5.β-内酰胺环的稳定：干燥条件下稳定。室温，3年以上；60℃，6周；150℃，1.5h.水溶液在ph6~6.8时较稳定。

　　遇酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子（铜、铅、汞和银）等作用，易发生水解和分子重排，导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性，一系列降解产物为青霉噻唑酸、青霉酸、青霉醛、青霉胺、α-青霉噻唑酰基羟胺酸和青霉稀酸等。

　　头孢菌素族：干燥条件下稳定。室温，3年以上；水溶液于25℃，24h失活性8%，酸、碱介质、β-内酰胺酶、胺类（氨、氨基酸、羟胺等）均能使本品降解。

　　（三）鉴别试验

　　1.钾、钠盐的火焰反应

　　2.呈色反应

　　1）羟肟酸铁反应 在碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环开环生成羟肟酸，在稀酸中与高价铁离子呈色。

　　2）硫酸-硝酸呈色反应 头孢菌素能与硫酸-硝酸反应后呈色，机理不清，但可区别。

　　3）茚三酮反应 α-氨基的本类药物，氨苄西林，蓝紫色；［医学 教育网 搜集整 理］

　　4）与斐林试剂反应 类似肽键（-conh-）结构，可产生双缩脲反应。开环分解使碱性酒石酸铜盐还原显紫色。中国药典（95版）收载阿莫西林、氨苄西林钠采用本法鉴别；

　　5）变色酸-硫酸呈色反应95版药典，阿莫西林加变色酸硫酸试剂混合后，于150℃加热2~3min，因分解出甲醛与变色酸缩合而呈深褐色；

　　6）与重氮苯磺酸呈色反应 头孢菌素族7位侧链含有-c6h5-oh基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应，显橙黄色；

　　7）与铜盐呈色 头孢氨苄加醋酸、硫酸铜、氢氧化钠试液后，生成铜配位盐，显橄榄绿色，用于区别。

　　3.沉淀反应

　　1）稀盐酸中生成白色沉淀 此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或过量的盐酸（与酰胺基成盐）中溶解；

　　2）有机胺盐的特殊反应

　　3）重氮化-偶合反应 普鲁卡因青霉素生成偶氮染料红色沉淀；

　　4）与三硝基苯酚的反应 苄星青霉素经氢氧化钠碱化后，乙醚提取，蒸去乙醚后的残渣含有二苄基乙二胺，加稀醇使残渣溶解，加三硝基苯酚的饱和溶液，加热后放冷，即析出二苄基乙二胺苦味酸盐结晶。

　　4.光谱法

　　1）紫外分光光度法（uv）

　　（1）最大吸收波长鉴定法

　　（2）水解产物的最大吸收波长鉴定法

　　2）红外吸收光谱法（ir）各国药典β-内酰胺类抗生素几乎均采用本法鉴定

　　3）核磁共振光谱法（nmr）

　　4）色谱法

　　（1）薄层色谱法（tlc） 本法被各国药典采用；

　　（2）高效液相色谱法（hplc）主峰的保留时间一致；

　　（四）含量测定

　　药典收载方法，如hplc、碘量法、汞量法、酸碱滴定法、可见紫外分光光度法等

　　1.碘量法

　　降解产物消耗碘

　　水解

　　氧化反应

　　未经水解的样品作空白校正。

　　2.汞量法：降解产物与汞反应

　　3.酸碱滴定法：可被碱水解，大量完成

　　4.可见-紫外分光光度法

　　1）酸水解法（铜盐法）

　　2）硫酸汞盐法

　　3）羟肟酸比色法

　　5.高效液相色谱法

　　较好的分离供试品中可能存在的降解产物、未除净的原料及中间体等杂质而准确定量。

　　中国药典收载的头孢唑林钠含量测定方法如下：

　　1.色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸氢二钠、枸橼酸溶液（取无水磷酸氢二钠1.33g与枸橼酸1.12g，加水溶解 并稀释成1000ml）-乙腈（88：12）为流动相；检测波长为254nm；头孢唑林的保留时间约为7.5min.头孢唑林峰与内标峰的分离度应大于 4，重复进样，其相对标准差（rsd）应小于2.0%.

　　2.内标溶液的制备 精取乙酰苯胺27mg，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，作为内标溶液。

　　3.测定法 取本品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；取10μl注入液相色谱仪；另取头孢唑林对照品约 50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液（PH7.0）5ml溶解后，再用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶 中，同法测定；按内标法计算供试品中CL4h14n8o4s3的含量。

　　4.计算 按内标法计算。

　　第三节 氨基糖甙类抗生素

　　以碱性环己多元醇为甙元，与氨基缩合成的甙，故称为氨基糖甙类抗生素，主要有链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素及巴龙霉素等，以庆大霉素和链霉素为例讨论

　　（一）链霉素a

　　1.结构特点 链霉素的结构为一分子链霉胍和链霉双糖胺结合而成的碱性甙。其中链霉双糖胺是由链霉糖与n-甲基-l-葡萄糖胺　所组成。链霉胍和链霉双 糖胺间的甙键结合较弱，链霉糖与n-甲基-l-葡萄糖胺间的甙键结合较牢。3个碱性中心，链霉胍上的碱性强（pka = 11.5），葡萄糖胺上的甲氨基 （pka = 7.7），可与无机酸或有机酸形成可溶于水的盐，临床常用其硫酸盐。［医学教 育网 搜集整理］

　　2.性质 硫酸盐易溶于水，难溶于乙醇、氯仿。

　　在PH5~7.5 最为稳定，过酸或过碱易水解失效。水解，链霉糖可重排为麦牙酚，为链霉素特有，可用于鉴别，链霉素在230nm处有紫外吸收。

　　3.鉴别试验（1）茚三酮反应； （2）n-甲基葡萄糖胺反应； （3）麦芽酚反应

　　4.检查

　　5.含量测定

　　（二）庆大霉素

　　1.结构和性质

　　2.鉴别试验（a）茚三酮反应； （b） n-甲基葡萄糖胺反应； （c）紫外光谱法； （d）tlc法

　　3.庆大霉素c组分的测定方法：

　　第三节 四环素类抗生素

　　1.化学结构与性质

　　2.鉴别试验（a）浓H2SO4反应； （b）FeCl3反应； （c）荧光法；

　　3.盐酸四环素中特殊杂质检查

　　4.含量测定

　　小结

　　1、β-内酰胺类抗生素的结构和性质，鉴别试验，含量测定方法。

　　（1）鉴别：（a）羟肟酸铁反应；

　　（b）焰色反应（盐类）；

　　（c）硫酸及硫酸-甲醛反应；

　　（d）紫外光谱

　　（e）红外光谱。

　　（2）含量测定：碘量法及HPLC法。

　　2、链霉素的结构和性质，鉴别试验。 鉴别之

　　（1）茚三酮反应；

　　（2）n-甲基葡萄糖胺反应；

　　（3）麦芽酚反应

　　3、庆大霉素的结构和性质，鉴别试验，庆大霉素c组分的测定方法：

　　（1）鉴别：

　　（a）茚三酮反应；

　　（b） n-甲基葡萄糖胺反应；

　　（c）紫外光谱法；

　　（d）TLc法

　　（2）庆大霉素c组分：为什么《中国药典》要规定控制c组分，用什么方法？

　　4、四环素类药物的结构和性质，鉴别试验，杂质检查和含量测定方法：

　　（1）

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