底物水平磷酸化：ADP或某些其它的核苷-5-二磷酸的磷酸化是通过来自一个非核苷酸底物的磷酰基的转移实现的。这种磷酸化与电子的转递链无关。

指在分解代谢过程中，底物因脱氢、医|学教育网搜集整理脱水等作用而使能量在分子内部重新分布，形成高能磷酸化合物，然后将高能磷酸基团转移到ADP形成ATP的过程。例如在糖的分解代谢过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢并磷酸化生成甘油酸-1，3-二磷酸，在分子中形成一个高能磷酸基团，在酶的催化下，甘油酸-1，3-二磷酸可将高能磷酸基团转给ADP，生成甘油酸-3-磷酸与ATP。